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深入解析數(shù)字PCR系統(tǒng)的工作流程及優(yōu)勢(shì)

發(fā)布時(shí)間:2023.04.03 16:56:26 信息來(lái)源: 閱讀次數(shù):


  數(shù)字PCR是一種高靈敏度的核酸絕對(duì)定量分析技術(shù),它繼實(shí)時(shí)熒光定量PCR之后,為科研和臨床領(lǐng)域提供了更為精確和可靠的核酸定量方法。數(shù)字PCR系統(tǒng)通過(guò)獨(dú)特的工作流程,實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸樣本的精確分區(qū)和擴(kuò)增,從而能夠準(zhǔn)確計(jì)算出核酸拷貝數(shù),為基因突變檢測(cè)、拷貝數(shù)變異分析、病毒微生物檢測(cè)等領(lǐng)域提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。
  一、工作流程
  數(shù)字PCR系統(tǒng)的工作流程包括樣本制備、反應(yīng)體系制備、分區(qū)或微滴生成、封蓋和熱循環(huán)、熒光信號(hào)檢測(cè)以及數(shù)據(jù)分析等步驟。
  1、樣本制備:
  這是數(shù)字PCR的第一步,涉及從生物樣本中提取DNA或RNA,或者使用已經(jīng)制備好的核酸樣本。樣本的質(zhì)量和純度對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要,因此,這一步需要嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程,確保樣本的完整性和代表性。
  2、反應(yīng)體系制備:
  根據(jù)數(shù)字PCR儀器和試劑的要求,制備包含引物、探針、dNTPs(脫氧核糖核苷酸三磷酸)、酶和緩沖液等的反應(yīng)體系。這一步驟要求精確控制各組分的比例和濃度,以保證PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行和擴(kuò)增效率。
  3、分區(qū)或微滴生成:
  將制備好的反應(yīng)體系分配到大量的微小分區(qū)或微滴中。這些分區(qū)或微滴是通過(guò)微流控技術(shù)、油包水乳化或其他方法生成的,每個(gè)分區(qū)或微滴都包含有反應(yīng)所需的全部組分,且相互獨(dú)立。這一步驟是實(shí)現(xiàn)高精度和高靈敏度的基礎(chǔ)。
  4、封蓋和熱循環(huán):
  將分區(qū)或微滴進(jìn)行封蓋,以防止在熱循環(huán)過(guò)程中的液體蒸發(fā)和污染。隨后,進(jìn)行PCR熱循環(huán),使目標(biāo)核酸在每個(gè)分區(qū)或微滴中進(jìn)行擴(kuò)增。熱循環(huán)過(guò)程中,通過(guò)精確控制溫度和時(shí)間,確保目標(biāo)核酸的有效擴(kuò)增。
  5、熒光信號(hào)檢測(cè):
  在熱循環(huán)過(guò)程中,使用熒光染料或探針來(lái)監(jiān)測(cè)目標(biāo)核酸的擴(kuò)增。當(dāng)目標(biāo)核酸被擴(kuò)增時(shí),熒光信號(hào)強(qiáng)度會(huì)相應(yīng)增加。每個(gè)分區(qū)或微滴中的熒光信號(hào)強(qiáng)度與其中存在的目標(biāo)核酸數(shù)量成正比,這為后續(xù)的定量分析提供了依據(jù)。
  6、數(shù)據(jù)分析:
  使用專(zhuān)門(mén)的軟件或分析方法,對(duì)每個(gè)分區(qū)或微滴的熒光信號(hào)進(jìn)行分析。根據(jù)泊松分布和陽(yáng)性比例,計(jì)算出核酸拷貝數(shù),實(shí)現(xiàn)定量分析。這一步驟需要強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理能力和統(tǒng)計(jì)分析技能,以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
  二、優(yōu)勢(shì)
  1、高精度:
  數(shù)字PCR技術(shù)通過(guò)將反應(yīng)體系分配到大量獨(dú)立的分區(qū)或微滴中,使得每個(gè)分區(qū)或微滴中的核酸拷貝數(shù)相對(duì)固定且可計(jì)數(shù)。這種方法避免了傳統(tǒng)PCR中由于模板濃度不均一而導(dǎo)致的誤差,從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸拷貝數(shù)的精確測(cè)量。因此,在基因表達(dá)、基因突變檢測(cè)等領(lǐng)域具有更高的精度和可靠性。
  2、高靈敏度:
  它能夠檢測(cè)到非常低濃度的核酸樣本,甚至能夠檢測(cè)到單個(gè)拷貝的核酸分子。這種高靈敏度使得數(shù)字PCR在病毒檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。同時(shí),還能夠通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系和條件,進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度,滿(mǎn)足更多領(lǐng)域的需求。
  3、無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):
  傳統(tǒng)PCR技術(shù)通常需要通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)進(jìn)行定量分析,而數(shù)字PCR技術(shù)則無(wú)需這一步驟。因?yàn)閿?shù)字PCR是根據(jù)每個(gè)分區(qū)或微滴中的熒光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)計(jì)算核酸拷貝數(shù)的,因此無(wú)需依賴(lài)外部標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正。這一特點(diǎn)簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作流程,減少了實(shí)驗(yàn)誤差,提高了實(shí)驗(yàn)效率。
  4、多重檢測(cè)能力:
  可以在單個(gè)PCR反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多種核酸序列。這使其在復(fù)雜樣本的分析中更具優(yōu)勢(shì),能夠同時(shí)獲取多種目標(biāo)核酸的信息,提高了實(shí)驗(yàn)的效率和準(zhǔn)確性。
  5、高耐受性:
  對(duì)抑制劑和污染物的耐受性較高,能夠在復(fù)雜的環(huán)境中進(jìn)行穩(wěn)定的PCR擴(kuò)增。這使得數(shù)字PCR在實(shí)際應(yīng)用中更具靈活性和適應(yīng)性,能夠應(yīng)對(duì)各種復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)條件。
  

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